Reacciones y enzimas del ciclo de Krebs

Degradación CH3CO-CoA.

El ciclo es una serie de ocho reacciones enzimáticas que degradan al grupo acetilo de la acetil-CoA a dos moléculas de CO2, con la formación de equivalentes de reducción (3 NADH, 1 FADH2) y un ATP. Todas las enzimas se encuentran en la matriz, a excepción de la succinato deshidrogenasa que está asociada a la membrana mitocondrial interna.

1. Citrato sintasa

La reacción de adición del grupo metilo (acetil-CoA) sobre el carbonilo del oxalacetato origina citril-S-CoA, que posteriormente asociado a la misma enzima es hidrolizado a citrato.

La Keq’ igual a 5x105 y el D Go΄ igual a - 7,7 Kcal mol-1, indican la irreversibilidad de la reacción, determinada por la hidrólisis de citril - CoA.

La enzima cataliza también la reacción del fluoroacetil-CoA y el oxalacetato formándose fluorocitrato, que inhibe la segunda reacción del ciclo de Krebs.

El fluorocitrato es una de las moléculas más tóxicas conocidas (LD50 = 0,2 mg k-1 de peso corporal en ratas). Se encuentra en hojas de algunas plantas venenosas de África, Australia y Sudamérica.

Fig.4 Modelo de la enzima citrato sintasa unida al sustrato oxalacetato (modelo esferas llenas) de corazón de cerdo. La enzima es un dímero, se muestra los monómeros en color azul y amarillo, y el oxalacetato en celeste y rojo.


2. Aconitasa.

Cataliza la interconversión ente los ácidos tricarboxílicos: citrato, cis-aconitato e isocitrato. En un primer paso hay una eliminación de una molécula de agua, sale el grupo hidroxilo del C-3 y un H+ del C-4 formándose el cis-aconitato, en un segundo paso de adición de agua al doble enlace, queda el grupo hidroxilo en el C-4 del ácido formado. De los dos estereoisómeros posibles del isocitrato sólo se forma uno. La enzima transfiere el grupo hidroxilo del citrato a un carbono adyacente, y convierte al citrato, alcohol terciario de difícil oxidación, a isocitrato, alcohol secundario fácilmente oxidable.

 

El D Go΄ igual a + 2,04 Kcal mol-1, es por lo tanto una reacción reversible en la que el equilibrio favorece la formación del citrato. 

Fig.5 Complejo aconitasa de bovino y a -metilisocitrato.
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3. Isocitrato deshidrogenasa, NAD+ dependiente.

Enzima alostérica, de PM 380 kD, formada 8 subunidades. Requiere de Mn2+ y Mg2+.

La enzima cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato a a -cetoglutarato. En un primer paso cataliza la oxidación del isocitrato a una cetona (oxalsuccinato), y posteriormente, la descarboxilación del carboxilato en posición b con respecto a la cetona. En esta reacción sale el primer CO2 del ciclo.

El D Go΄ igual a - 5,0 Kcal mol-1 favorece la descarboxilación sobre la carboxilación reductora, se trata sin embargo, de una reacción reversible.


Fig.6 Complejo de la isocitrato deshidrogenasa de E.coli con NAD+ y Ca2+.
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4. Complejo a -cetoglutarato deshidrogenasa.

Este complejo cataliza la descarboxilación oxidativa del a -cetoglutarato liberando los segundos CO2 y NADH del ciclo. La reacción global es semejante a la catalizada por el complejo multienzimático piruvato deshidrogenasa.

 

El producto de la reacción es succinil-CoA, un tioéster de "alta energía". El D Go΄ es igual a – 8,0 kcal mol- 1, la reacción es irreversible.

5. Succinil-CoA sintetasa.

Enzima conocida también como succinato tioquinasa, que cataliza la hidrólisis del compuesto succinil-CoA y la síntesis acoplada del un nucleósido trifosfato de alta energía (fosforilación a nivel de sustrato).

Es una reacción reversible, con una Keq’ igual a 3,7 y D Go΄ igual a – 0,7 kcal mol-1.



En mamíferos la enzima utiliza el GDP, se sintetiza entonces GTP. En cambio plantas y bacterias, sintetizan directamente ATP. Ambas reacciones son equivalentes, ya que ATP y GTP se interconvierten mediante la acción de la enzima nucleósido difosfato quinasa, reacción que posee un D Go΄ igual a 0.


Fig.7 Succinil-CoA sintetasa unida al sustrato
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6. Succinato deshidrogenasa.

Las reacciones restantes del ciclo oxidan al sucinato a oxalacetato, éste al regenerarse, permite otra vuelta del ciclo. La succinato deshidrogenasa cataliza la oxidación estereoespecífica del enlace - CH2 –CH2 – del succinato a doble enlace trans, dando el fumarato.

La enzima succinato deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de Krebs que no se encuentra en la matriz mitocondrial, sino que en la membrana mitocondrial interna, con el sitio de unión del sustrato accesible desde la matriz. Es además la única en el ciclo asociada a un grupo prostético flavínico (FAD) mediante el cual los equivalentes de reducción del succinato son transferidos a la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En general la función bioquímica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida alcoholes a aldehídos o cetonas. El malonato es un fuerte inhibidor competitivo de la enzima.

7. Fumarasa o fumarato hidratasa.

La fumarasa (fumarato hidratasa) cataliza la adición estereoespecífica de agua al doble enlace del fumarato, formando L-malato.

La enzima está formada por 4 cadenas polipeptídicas, tiene un PM = 400 kD. La reacción es reversible cuya Keq es igual a 4,5. En la dirección inversa la enzima participa en la eliminación de agua del L-malato (no del D-malato) formándose el isómero geométrico trans, el fumarato (no el isómero cis).

Fig.8 Fumarasa (cadenas A y B) de E.coli asociada a citrato.
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8. L-malato deshidrogenasa.

La constante de equilibrio de la reacción a pH 7,0 (D Go΄ = + 7,1 kcal mol-1) está desplazada hacia los reactantes.


Dada esta constante de equilibrio es esencial para la operación del ciclo que la reacción catalizada por la citrato sintasa sea irreversible. Hay isoenzimas de la malato deshidrogenasa fuera de la mitocondria. En el citosol y en la matriz del peroxisoma está asociada al NAD+, en el estroma de cloroplastos la enzima es dependiente del NADP+.

Fig.9 Complejo malato deshidrogenasa de E.coli con NAD+ y L-malato.
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Ecuaciones del ciclo de Krebs.

CH3CO~ SCoA + oxalacetato 2- + H2O

citrato 3-

isocitrato 3- + NAD+ + H+

a KG 2- + NAD+ + HSCoA + H+

succinil ~ SCoA 1- + ADP3- + Pi2-

succinato2- + FAD

fumarato 2- + H2O

L-malato 2- + NAD+

Þ

Û

Û

Þ

Û

Û

Û

Û

citrato 3- + HS-CoA + H+

isocitrato 3-

a KG 2- + CO2 + NADH + H+

succinil ~ S-CoA 1- + CO2 + NADH + H+

succinato2- + ATP4- + HS - CoA

fumarato 2- + FADH2

L-malato 2-

oxalacetato 2- + NADH + H+

 

Ecuación global del ciclo de Krebs.

CH3CO~ SCoA + 3 NAD+ + 2 H2O + FAD +
ADP3- + Pi
2- + H+

Þ

2 CO2 + HS - CoA + 3 NADH + 3 H+ +
FADH2 + ATP 4-